Красители для ПЦР в «реальном времени»
В современных вариантах ПЦР в «реальном времени» уже достаточно давно используют одновременно несколько флуоресцентных зондов, меченных разными флуоресцентными красителями — так называемые «мультиплексные» варианты ПЦР в «реальном времени»(multiplex Real-Time PCR). Это позволяет детектировать в одной пробирке одновременно несколько продуктов ПЦР. Что бывает очень удобно в случае, например, определения уровня экспрессии гена, когда можно взяв два зонда с разными флуоресцентными красителями определить соотношение экспрессии нужного гена к «house keeping» гену в одной реакционной смеси для одной и той же пробы. Во многих современных приборах для ПЦР в «реальном времени» предусмотрены варианты детекции нескольких флуоресцентных красителей одновременно. Для этого детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном для него диапазоне (канале). Даипазон этот выбирается таким образом, чтобы детектировать сигнал только одного красителя, и не залезать в область соседних.
На картинке приведены спектры флуоресценции для четырех красителей: FAM, HEX, ROX и Cy5. Как можно видеть, если настроить прибор на детекцию сигнала в максимуме флуоресценции каждого красителя, то остальные красители в этом максимуме будут иметь очень низкую флуоресценцию и ей можно пренебречь. Таким образом, в данном случае мы можем получить четыре независимых канала для использования в multiplex Real-Time PCR. Каналы обычно называют по названию красителя, максимум которого они детектируют. На сегодняшний день широко известны пять каналов:
1. Канал FAM/SybrGreen
2. Канал JOE/HEX
3. Канал TAMRA/Cy3
4. Канал ROX/SuperROX
5. Канал Cy5
Самые распространенные варианты multiplex Real-Time PCR: на два канала — FAM и HEX, на три канала — FAM, HEX и Cy5, на четыре канала — FAM, HEX, ROX и Cy5
Совсем не обязательно чтобы название канала совпадало с названием красителя, главное чтобы используемый краситель спектрально соответствовал характеристикам канала. Так например, для канала JOE можно использовать зонды с красителем HEX или VIC. Подобрать подходящий краситель для использования в ПЦР в «реальном времени» довольно трудно, поскольку нужно, чтобы он обладал хорошими спектральными свойствами, то есть флуоресцировал в нужном диапазоне своего канала, и при этом не флуоресцировал в соседних каналах. Так же очень важным является его химическая и фотостабильность и возможность применения в синтезе олигонуклеотидов.
Красители для канала FAM/SybrGreen. Выбор красителей для этого канал не велик, это собственно сам FAM. Исторически первый и самый простой краситель для очень многих биологических задач. Так же в этом канале детектируется сигнал при использовании интеркалирующего красителя SybrGreen.
Красители для канала JOE/HEX. На сегодняшний день в зондах для ПЦР в «реальном времени» для второго канала можно использовать пять разных флуоресцентных красителей. Это HEX, JOE, VIC, Yakima Yellow и R6G. Исторически первыми красителями для второго канала начали использовать красители HEX и JOE, поэтому большинство приборов для ПЦР в «реальном времени» выпущенных до 2002 года имеют в списке каналов либо просто канал JOE, либо канал JOE/HEX. Фирма Aplied Biosystems разработала собственный краситель для этого канала — VIC, поэтому в последних приборах этой фирмы в название канала входит этот краситель.
У каждого из этих красителей есть свои недостатки. Так краситель JOE довольно трудоемко и дорого использовать при синтезе олигонуклеотида. Краситель HEX сравнительно легко встраивается в олигонуклеотид и имеет хороший спектр флуоресценции, но имеет не высокий квантовый выход. Тоже самое касается и красителя Yakima Yellow. HEX на сегодняшний день является, наверное, самым распространенным в мире красителем для использования в multiplex Real-Time PCR. Краситель R6G — самый дешевый вариант красителя для этого канала, но у него есть существенный недостаток, на некоторых приборах для ПЦР в «реальном времени» зонды с R6G флуоресцируют и в канале FAM, что в некоторых случаях затрудняет интерпретацию полученных результатов. Также есть информация, что «свечение» в канале FAM увеличивается для зондов с R6G с течением времени. В мире практически никто не использует зонды с R6G. Самый, наверное, подходящий вариант красителя для второго канала — это краситель VIC, который идеально подходит по своим спектральным и химическим свойствам, но имеет один недостаток — высокую цену.
Канал TAMRA/Cy3. Краситель TAMRA одно время широко использовался в ПЦР в «реальном времени» как тушитель для красителя FAM. Однако TAMRA может применяться в зондах и в качестве красителя. Синтез олигонуклеотидов с TAMRA трудоемок и дорог. Альтернативным красителем для этого канала является цианиновый Cy3, введение его в олигонуклеотид проходит относительно просто, но он заметно проигрывает TAMRA в квантовом выходе.
Канал ROX/SuperROX. Для этого канала используют краситель ROX. В последнее время стал приобретать популярность еще и краситель SuperROX, который проще чем ROX вводится в олигонуклеотид. Так же для этого канала используют зонды меченые цианиновым красителем Cy3.5, но у него, по сравнению с ROX, заметно ниже квантовый выход.
Канал Cy5. К сожалению, для этого канала в силу спектральных свойств, а именно большой длина волны у максимума флуоресценции — 655 нм, кроме цианинового красителя Cy5 больше ничего не подходит. Сам краситель Cy5, имеет довольно много ограничений при синтезе олигонуклеотида, поэтому его синтез относительно дорогой и трудоемкий.
Тушители для ПЦР в «реальном времени».
На сегодняшний день существует уже довольно много различных тушителей, которые применяют для ПЦР в «реальном времени». Основная задача такого тушителя это сделать исходное (фоновое) значение флуоресценции зонда, как можно меньше, с тем, чтобы затем в результате ПЦР, зонд «разгорелся» как можно лучше. Для этого тушитель должен обладать существенной поглощающей способностью (молярной экстинкцией) в диапазоне флуоресценции соответствующего ему флуоресцентного красителя. В принципе, на приборах для ПЦР в «реальном времени» результаты «разгорания» зонда представляются в виде уже обработанных и нормализованных кривых, поэтому для определения Ct в общем-то не важно абсолютное значение «разгорания» зонда. Для определения количества ДНК достаточно и минимального «разгорания», которое будет достоверно фиксироваться прибором для ПЦР в «реальном времени». Но чтобы иметь более красивые кривые и более точно определенные значения Ct, желательно добиваться наибольшего соотношения фоновая флуоресценция/конечная флуоресценция.
Для зондов типа Taqman, у которых молекулы тушителя и красителя разнесены в пространстве, эффективное тушение достигается за счет подбора тушителя соответствующего спектрально флуоресцентному красителю. Самый распространенный и давно известный тушитель — DABCYL. Он неплохо подходит для тушения красителя FAM. Однако, на сегодняшний день наибольшее распространение получили тушители семейства Black Hole Quenchers (BHQ) фирмы Biosearch.
Таблица. Возможность комбинирования различных тушителей и красителей в зондах для ПЦР в «реальном времени».
| Краситель/тушитель | BHQ1 | BHQ2 | BHQ3 |
|---|---|---|---|
| FAM | + | — | — |
| HEX | + | + | — |
| ROX | — | + | — |
| Cy5 | — | + | + |
Тушитель можно подобрать исходя из соответствия длине волны флуоресценции красителя (см. Таблицу). Так для красителя FAM хорошим вариантом является BHQ-1, для красителя HEX можно применять как BHQ-1 так и BHQ-2, для ROX подходит BHQ-2, а для Cy5 можно использовать и BHQ-2 и BHQ-3.
Существуют несколько менее распространенных тушителей. Например, тушитель Eclipse фирмы Epoch, который неплохо подходит для красителей FAM и частично HEX. Кроме этого, для тушения FAM раньше часто применяли краситель TAMRA. Конечно, последний вариант невозможно применять в «мультиплексном» варианте ПЦР в «реальном времени». Для зондов типа Beacon, точное спектральное соответствие между тушителем и красителем уже не настолько важно. Поскольку молекулы тушителя и красителя сближены в пространстве, имеет место так называемое «контактное тушение». В этом случае даже такие пары как Cy5-DABCYL вполне приемлемо работают. В принципе, чем ближе находятся молекулы тушителя и красителя, тем лучше эффект тушения и ниже фоновая флуоресценция. Для этого например, были сделаны варианты зондов типа Taqman, у которых молекулы красителя находятся не на 5′ конце олигонуклеотида, а встроены в середину цепи, таким образом расстояние можно сократить до минимальных 6-7 нуклетидов и заметно увеличить эффективность «разгорания».